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        PCR產物直接測序

        PCR產物直接測序有兩大優點∶
        一是操作易于標準化與自動化,因為它是一個單一的酶的反應過程,不依賴于生物體;
        二是通過一次測序反應就能確定樣品中某個等位基因的順序,而PCR產物克隆后測序時,樣品順序要在測定了數個克隆片段之后才能確定。因為只有這樣,才能區別突變是基因組本來就有的,還是由于Tag聚合酶在PCR過程中錯誤摻入核苷酸引起的。

        PCR產物直接測序效果的好壞與其相關的每個步驟都有重要的關聯,具體包括以下幾個方面。

        1 PCR反應條件的優化

        PCR反應及PCR產物本身是會干擾測序反應的,有數點需要注意∶
        ①一條PCR產物通常較短小(<1 000 bp),兩鏈很容易產生重退火現象,因此阻礙測序引物與DNA模板的退火,同時也會損害測序酶讀序的能力;
        ②PCR反應中剩余的核苷酸可干擾測序反應。因為大量的未經反應的核苷酸帶進測序反應中,打擾dNTPs/ddNTPs的比率,從而減少了ddNTPs的置入,最終減弱測序反應的信號;
        ③多余的PCR引物會與測序引物產生競爭,使測序反應信號減弱;④未經優化PCR反應會產生額外PCR條帶,影響測序的結果。假如想增強信號,而去增加測序反應DNA的模板的量,即增加PCR產物的量,只會導致測序反應產生更多的“污染”,因此PCR產物會帶來多余的核苷酸及PCR引物。所以一般pcr產物測序之前需要經過純化試劑盒純化PCR反應體系殘留混合物(dNTP、引物和鹽離子等)以后再測序。

        PCR直接測序的效果與PCR擴增的特異性和制備測序模板所采用的方法有關,只有獲得特異性高的PCR產物,才可獲得準確度高、有效閱讀測序長的結果。PCR的特異性可以通過摸索最佳循環參數和緩沖體系、重新設計寡聚核苷酸引物等方法加以提高。若擴增的片段是基因組DNA,將第一次擴增產物的低濃度稀釋物進行第二次擴增,即可以有效地降低PCR產物測序產生的背景。

        不管測序技術如何提高,各種測序方法的結果表明,起始與結束的一段序列(大概為20~30堿基)的準確度都較中間的序列低,因此為了得到最佳結果,片段應該大于200 bp;對于檢測基因點突變的測序,則需將含有點突變的熱點(hot spot)區段設計在測序結果最可靠的區域,即100~200堿基之間。

        2 PCR產物的純化

        若擴增產物經凝膠電泳顯示為一條整齊、細銳的帶,即擴增特異性高時,可以過膜器純化,或用成熟的PCR純化試劑盒進行純化;雖然只要限制PCR反應的核苷酸及引物的用量,或僅稀釋PCR產物,PCR產物未經純化可以直接測序,但經過常規性的PCR產物的純化,一般都可以保證得到可靠的測序結果。若存在非特異性擴增產物,必須先經凝膠電泳,將PCR產物與引物、非特異性產物分離開來,切割下PCR產物帶,然后可以通過沉淀方法純化,根據多次實驗的經驗,此時最好還是繼續優化PCR條件,不得已才采此下策。值得注意的是,所有的純化方法在使用之前,必須證明該方法是切實可行的。

        3 測序引物的設計

        測序引物的設計總體原則和設計PCR引物相似,具體還有以下要求∶一般引物長度應至少比18個堿基長,以確保引物與模板較好的雜交,而且也減少了與載體或插入位點形成二級結構;避免引物中存在單個堿基的重復(例如超過3個或4個重復堿基,特別是G或C);對于循環測序,引物Tm的值應該高于45℃,一般為50~65℃之間;引物G-C含量盡可能在40%~50%之間;引物與模板DNA應該完全結合;避免引物具有二級結構,或引物雜交形成二聚體。

        在測序反應中,使用跟PCR反應中同一的引物,或許會有很好的結果。但是,最好使用內套引物,這會增加退火及測序反應的特異性。一般要求測序引物5′末端最少與PCR引物的3′末端距離20個堿基,這會增加反應的特異性,避免內套引物與其他PCR反應中的引物二聚體產生退火。另外也可加一個M13引物于特定引物末端,有助于測序,但如此則只有M13引物能用于測序。對于未知其序列的克隆片段,可用與載體多聚接頭或其附近循序互補的寡聚核苷酸作為擴增引物。

        值得注意的是PCR擴增引物不一定可用于測序,這是因為測序所用引物的結構條件比PCR用的嚴格,而且測序用引物純度要比PCR用引物的要求高,所以,用PCR用引物擴增出來PCR的產物,在使用PCR用引物測序時,有測不出來的可能。

        4 PCR產物直接測序的準確性問題

        為了保證測序結果的特異性,在測序之前,應該把PCR產物和另一已定量的DNA樣品(marker)同時進行電泳,就可知道該PCR產物的相對分子量大小、含量、純度,并預測其在測序中的特異性?梢哉f模板的純度和準確定量是取得好測序結果的關鍵。我們對PCR產物的濃度要求是50ng/ul,最低濃度不得小于30ng/ul,提供的量不少于20ul,已純化的DNA樣品必須溶于去離子水中,如果溶于TE緩沖液中的樣品一般測序數據都會受到影響,嚴重時甚至導致測序反應失敗。PCR產物純度鑒定已電泳條帶單一無拖帶.雜帶為準,對于存在引物二聚體的樣品一定要選擇膠純化。

        對于未知序列的測定以及基因的確定,僅一次實驗的結果是不可信的,需多次重復才可確定。有文獻報道,需從PCR制備測序樣品這一步開始重復,而且要從不同的方向或同一方向、不同的測序化學反應類型進行測序,一般不主張同一方向或同一化學的重復。

         

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