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      1. 首頁 > 服務產品 > 測序圖的判別
        測序圖的判別

        1.PCR產物電泳檢測條帶單一,為什么測序結果說模板不純?

        答:PCR產物電泳檢測的結果只是一個粗略的定性結果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴增產物是無法用肉眼區分開的。但是DNA測序反應敏感而客觀,可以直接反應出模板本身的情況。需要強調的是,高質量的PCR產物才可能得到高質量的測序結果,如果您對PCR產物的純度不很確定,希望您可以將PCR產物進行克隆處理,以確保得到好的測序結果。以下圖為例:該反應的背景信號較高,不利于堿基的判讀。

        圖1:

        解決辦法:改變PCR條件,重新擴增;蛘呖梢詫⒃揚CR產物克隆到質粒中,初步篩選后進行單克隆測序。

        2.什么是堿基缺失?

        圖2

        堿基缺失常見在PCR產物中,特別是從基因組中擴增得到的PCR片段,上圖的186位缺失兩個連續的T 解決方法: (1) 使用反向引物繼續測序,以矯正缺失位點并達到測通的目的;蛘邔⒃揚CR產物克隆到質粒中,挑取單克隆測序。 (2) 如果可以確定該PCR片段中不應該有缺失的位點,那么可以改變PCR反應條件,重新擴增

        3.什么是引物不純?

        圖3:

        引物不純造成移碼現象,該種現象與模板雜在峰圖都表現為背景峰較雜,但是引物不純在峰圖上表現的更有規律,一般在每一個主峰前或者后都有一個同一堿基的小峰。解決辦法:重新合成引物。

        4.重復結構對測序有哪些影響?

        圖4:

        重復結構將導致測序復制框的滑移,重復結構之后峰型混亂解決辦法:使用反向引物對模板進行測序,測到該重復結構處,即可完成模板全長的拼接。

        5.什么是模板不單一?

        圖5:

        (1) 菌液為非單克。 下圖是pGEM-T載體測序的結果,在83位點處測序結果出現雙峰(插入后雙峰),即模板中含有兩個或兩個以上的相同載體,但是插入片段不同。 解決辦法:重新挑取單克隆或者重新提取質粒。需要注意的是,重新進行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段,并不足以證明模板的單一。 (2) PCR產物不純

        圖6所示:

        在197bp前測序峰表現為雜或有明顯套峰,且在197bp位置有一個高高的A峰,這個A峰標志著此PCR產物中有一個片段大小為200bp左右的小片段解決方法:對PCR產物切膠純化,再進行測序。

        6.Poly結構的測序結果是怎樣的?

        圖7

        圖8:

        圖9:

        7.含有回文結構的模板測序結果是怎樣的?

        圖10:

        位點94至137是一個回文結構,該結構導致后面的信號衰減,出現錯誤的判讀。 解決方法:使用反向引物對模板進行測序,測到該回文結構處,即可完成模板全長的拼接。

        8.測序峰圖為前雙峰的結果是什么樣的?

        圖11:

        (1) 產物中含有小片段PCR產物;(2) 引物有兩個結合位點,其中一個結果中斷。 (2) 解決方法:換引物反向測序。

        9.測序峰圖為后雙峰是什么樣的?

        圖12

        原因和解決方法同回文結構及插入后雙峰。

        10 無信號的結果:信號值(ATGC的平均值)皆小于100

        圖13

        測序無信號的判定: 在確認引物、質粒抽提濃度、反應安排等條件無問題的情況下,測序結果峰型雜亂且信號值小于100的結果;此時則判定結果為測序無信號。兩次測序無信號,我們會取消實驗。

        11.沒有任何干擾的結果

         

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