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      1. 首頁 > 服務產品 > CDNA文庫構建及EST測序服務
        CDNA文庫構建及EST測序服務

        構建cDNA文庫已成為研究功能基因組學的基本手段之一。由于cDNA不像基因組DNA含有內含子而難于表達,因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因,并直接用于該目的基因的表達。

        • 通過構建cDNA表達文庫,
        • 可以提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針;
        • 可以用于分離全長基因進而開展基因功能研究

        而cDNA文庫具有組織細胞特異性,使得它在個體發育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值,因此成為了研究工作中最常使用到的基因文庫。

        技術特點:

        1.采用Clontech公司SMART技術,高效構建普通cDNA文庫 ;

        2.有效去除rRNA、tRNA,提高文庫中有效信息量;

        3.特有的全長cDNA文庫構建方法,全長率最高可達90%;

        4.嚴格的質量控制,確?蛻舻玫綕M意的cDNA文庫.。

        EST測序

        對構建好的文庫進行測序,達到常規測序質量標準,平均有效讀長超過600bp!

        實驗方案:

        實驗方案

        備注

        第一階段
        1)以客戶提供的組織材料提取總RNA,分離mRNA,純化總mRNA后,進行反轉錄合成cDNA第一鏈。
        2) 通過引物延伸或LD-PCR法進行dscDNA合成,經sfiI酶切后,經層析柱分離cDNA(回收大于500bp的cDNA)。
        3) 將分級純化的dscDNA與sfiI酶切的逆轉錄病毒載體pRetro-Lib(Amp抗性)連接。
        4) 將重組產物轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞

        客戶能提供保質保量的組織(5g)或者細胞株(2×107細胞)

        第二階段

        1. 甘油保存大腸桿菌文庫
        2. 初級cDNA文庫的檢測

        1) 不同稀釋度測定平均滴度,檢測庫容量(重組子克隆數目)。
        2)隨機挑取40個克隆子,PCR方法或sfiI酶切檢測重組克隆子比例(重組率),檢測平均插入片段大小。
        3) 每個文庫隨機挑取20個克隆子抽提質粒進行雙向測序,通過序列分析判斷插入片段是否含有全長ORF。

        文庫驗收標準:
        庫容量: >1×10 7 cfu/ml
        平均插入片段: >1.2 kb
        重組率:>95%
        全長基因比例:>65%

        向客戶提供的結果及材料:
        1、不同稀釋度生長的重組克隆培養皿照片(若干張)。
        2、構建好的初始cDNA文庫的菌液(含甘油)4ml。
        3、協商提供一定數量的PCR鑒定電泳圖(含marker標注)和克隆子插入片段長度數據(表格) 。
        4、50個隨機克隆子的雙向測序報告。
        5、文庫的評價,包括庫容量、插入片段平均長度、重組效率、 cDNA 完整性評價。

        第三階段文庫擴增
        按Creator™ SMART™ cDNA Library Construction Kit進行文庫擴增,并測定滴度。

        文庫驗收標準:
        庫容量: >1×10 8 cfu/ml

        向客戶提供的結果及材料:
        1、擴增所需的培養皿數量計算過程和重組克隆培養皿照片(若干張)
        2、20ml擴增文庫的菌液(含甘油),分裝1ml/管(凍存-80℃)。

        報價:

        cDNA 文庫構建

        項目

        內容

        價格

        Smart cDNA文庫

        cDNA文庫構建

        14000元

        全長cDNA文庫

        全長cDNA文庫構建

        75000元

        EST測序 (詳見EST測序)

        <5000條

        22元

        5000-10000條

        20元

        >10000條

        18元

        送樣要求

        RNA>20μg

        實驗周期

        4-6周

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