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      1. 首頁 > 服務產品 > DNA測序常見問題分析與解答
        DNA測序常見問題分析與解答

        1、DNA測序樣品用什么溶液溶解比較好?
         
        答:溶解DNA測序樣品時,用滅菌蒸餾水溶解最好。DNA的測序反應也是Taq酶的聚合反應,需要一個最佳的 酶反應條件.如果DNA用緩沖液溶解后,在進行了測序反應時,DNA溶液中的緩沖液組份會影響測序反應的體系條件,造成Taq酶的聚合性能下降。
        有很多客戶在溶解DNA測序樣品時使用TE Buffer。的確,TE Buffer能增加DNA樣品保存期間的穩定性,但TE Buffer對DNA測序反應有影響,根據我們的經驗,我們還是推薦使用滅菌蒸餾水來溶解DNA測序樣品。
         
        2、提供DNA測序樣品時,提供何種形態的比較好?
         
        答:我們推薦客戶提供菌體,由我們來提取質粒,這樣DNA樣品比較穩定。
        如果您要以提供DNA樣品,我們也很歡迎,但一定要注意樣品純度和數量。 提供的測序樣品為PCR產物時,特別需要注意DNA的純度和數量。PCR產物應該進行切膠回收,否則無法得到良好的測序。有關DNA測序樣品的詳細情況請嚴格參照“測序模板的要求”部分的說明。
         
        3、提供的測序樣品為菌體時,以什么形態提供為好?
         
        答:一般菌體的形態有:平板培養菌、穿刺培養菌,甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養菌 或新鮮菌液。平板培養菌運送特別不方便,我們收到的一些平板培養菌的培養皿在運送過程中常常已經破碎,面目全非,需要用戶重新寄樣。這樣既誤時間,又浪費客戶的樣品。一 旦是客戶非常重要的樣品時,其后果更不可設想。而甘油保存菌則容易污染。
        制作穿刺菌時,可在1.5ml的Tube管中加入瓊脂培養基,把菌體用牙簽穿刺于瓊脂培養基(固體)中,37℃培養一個晚上后便可使用。穿刺培養菌在4℃下可保存數個月,并且不容易污染,便于運送。
         
        4、與測序引物有關的問題:
         
        答:對于通用測序引物,只要正確使用,一般不會有太大問題,測序引物問題主要發生在客戶自己提供的PCR引物上。應該明確的一點是并不是所用的用于PCR的引物都可以用來作測序,以下幾種PCR引物將是不適合用作測序引物的:
        (1)簡并引物,
        簡并引物必然要在測序模板上有多個結合位點,直接影響測序結果。
        (2)隨機引物,如RAPD引物,
        隨機引物一般都比較短,所用退火溫度低,在測序反應的條件下,不能很好地與模板結合。
        (3)過長的引物,一般要求測序引物不大于24bp,最長不能超過30bp。
        過長的引物在測序反應的較低的條件下容易在測序模板上有多個結合位點,導致測序結果背景較長的引物純度也將難以保證。通常用于測序的引物純度要在90%以上,引物純度低時,測序反應的背景將明顯增大,直接影響到測序結果。
        (4)有特殊標記的引物,
        該情況主要指熒光標記的引物。我們測序反應的四種堿基都是熒光標記的,這樣,熒光標記的引物將產生干擾。另外,其他一些有大的標記基團的引物也最好不要用于測序。引物上大的標記基團將直接影響到DNA片段的遷移率,導致測序結果峰型不好或錯誤。
        (5)不純的引物,
        測序引物對純度的要求很高,合成的引物中非全長的片段可以造成較強的背景。以一個20bp的測序引物為例,直接脫鹽純化的話,純度至多在70%左右,也就是說將有30%的引物將作為背景噪音,這必將嚴重影響測序結果。 一般經PAGE或OPC法純化的引物基本能達到測序的要求。
         
        5、怎樣選擇(設計)測序用引物?
         
        答:測序用引物要求非常嚴格,不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結合,3’端的幾個堿基能完全配對,即使引物長達80~100多個堿基,只要調整PCR反應條件,也能成功進行PCR反應。 而測序用引物便不一樣了,必須嚴格符合以下要求。本公司的測序用引物全用引物設計軟件Primer設計。在本公司測序時,我們可免費幫助設計測序用引物。
        (1)長度在15~25個堿基左右,一般選擇20個堿基(根據GC含量作適當調整),
        (2)3’端盡量選擇G或C堿基(但不絕對),以增加與模板的結合能力。
        (3)Tm溫度應選擇50℃~70℃左右。
        (4)GC含量應選擇在50%左右,盡量避開A、T、G、C的連續結構。
        (5)避開引物自身形成發夾結構或引物二聚體結構等復雜結構。
        (6)保證引物和模板100%匹配,特別是3’端的幾個堿基一定要100%匹配。同時必須嚴格保證引物和模板之間只能有一個結合位點。
         
        6、PCR片段直接測序和PCR片段經克隆后測序的結果有何區別?
         
        答:眾所周知,PCR壙增過程中會出現很多錯配現象,但不可能所有的錯配都發生在同一位置。PCR片段直接測序時,其結果是PCR片段眾多分子的混合物的結果。如果在某一個點上出現了幾十次錯配現象,但大多數分子(或許是幾十萬個分子)在這個點上應該還是正確的,在測序時,錯配現象也就是反映不出來了。因此,PCR片段直接測序的結果反映的是PCR用模板最原始的結果。而PCR片段經克隆后測序是測定了某一個分子的DNA序列。在幾十個循環的PCR擴增過程中,很難保證某一個分子的任何點都不發生錯配。因此,PCR片段經克隆后的測序結果,往往存在著一些錯配的序列,和PCR片段直接測序的結果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現象的多少取決于PCR擴增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴增過程中的錯配現象,在PCR反應時,請選用保真性能高的DNA聚合酶。
         
        7、測序結果不到800Bases,還照常收費了,為什么?
         
        答:如在DNA樣品中的DNA序列分布勻稱,沒有復雜結構時,正常的測序反應能保證達到800Bases以上。但有一些DNA樣品立體結構復雜,造成聚合酶延伸反應終止,測序信號突然減弱或消失,或者測序結果出現套峰現象,出現這些現象的原因由DNA模板本身所造成(公司保證進行2次以上的測序工作)。
        在于聚合酶進行聚合反應時,由于A或T的連續,聚合酶難以識別完整的每個A或T,在某個A或T的后面便開始進行A或T連續結構以后序列的聚合反應(打滑現象),造成測序結果紊亂,出現套峰。
        一般在多少個A或T的后面能出現這種情況呢?現在還沒有這方面的報道。根據我們的經驗,這一情況的出現和A或T的連續結構后面的序列的排列情況有著直接的關系。有時10多個A或T的連續結構后面便出現套峰,但有時60~70個A或T的連續結構后面的序列也一樣可以完整地讀出來。具體情況還有待考證。
        一般來說,PCR片段直接測序時,A或T的連續結構后面的序列測序結果都會出現套峰。原因在于測序時經歷了PCR反應及測序反應(測序反應本身也是PCR反應)二次聚合酶的打滑現象。
        (3)原因不明的復雜結構,測序結果出現突然信號減弱或消失。從序列上看,DNA堿基排列并無特別異常。 估計是DNA整體出現復雜結構,從某一位置開始聚合酶的聚合反應便無法進行。
         
        8、出現套峰的原因是什么?
         
        答:在測序反應中,模板或引物的原因都可能造成套峰的形成,歸結其形成原因有以下幾點:
        (1)測序引物在模板上有兩個結合位點形成套峰;
        (2)模板不純,如果是質;蚴蔷,原因是非單克隆,如果是PCR,原因為非特異性條帶;
        (3)模板序列的特殊結構,如poly結構、發卡結構等;
        (4)引物降解,引物不純,或引物的特異性不好。
         
        9、我為什么找不到我的PCR引物?
         
        答:以下幾種情況,我們將無法找到做PCR時的引物序列
        (1)用PCR引物作為測序引物進行測序時,所測序列是從引物3’末端后第一個堿基開始的,所以自然就找不到您的引物序列了。有兩種方法可以得到您的引物序列。對于較短的PCR產物(<800bp),可以用另一端的引物進行測序,從另一端測序可以一直測到序列的末端,就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補序列。對于較長的序列,一個測序反應測不到頭,因此就只能將您的PCR產物片段克隆到適當的載體中,用載體上的通用引物進行測序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離,因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準確讀出,因此,您如果想得到您的PCR產物的完整序列,最好克隆后進行測序。
        (2 PCR產物用T載體克隆后,由于克隆的方向是隨機的,因此,當您在一條鏈上找不到您的引物序列時,試圖在互補鏈上尋找您的引物序列。
        (3)當測序引物離您的插入片段很近時,有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾,造成起始區的序列不好,可能無法找到您的引物完整序列。
        (4)有時,質粒做模板進行測序時,由于某些原因,質粒上沒有插入外援片段,為空載列完全為載體序列,此時自然也找不到引物序列。
         
        10、我的基因序列與標準序列為什么有差別?
         
        答:一段基因序列經擴增后,克隆到載體中進行測序。在兩個層次上可能導致序列發生變化。首先在PCR擴增過程中就可能產生錯誤。將片段克隆到載體中也有可能發生突變。其次,測序的準確率問題。ABI公司承諾其儀器的測序精度在一定范圍內可以達到98.5%以上。由于儀器準確率的限制,在一個較長的序列中發生堿基序列錯誤是難以避免的。在確認克隆無誤的情況下,通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。您如果想得到您的最準確的序列,進行雙向測序是很有必要的。只進行簡單的單向測序,我們無法保證所測序列的完全準確性,這是由儀器的精度決定的。
         
        11、過短的PCR產物為什么不適于直接測序?
         
        答:首先過短的PCR產物純化困難,一般的PCR產物純化試劑盒都要求PCR產物片段大于150bp,過短的PCR產物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用于測序的PCR產物一般不低于150bp長度。其次,由于測序技術本身的限制,測序反應對環境的干擾比較敏感,模板太短干擾更大,很容易造成測序失敗。
         
        12、用測序的方法檢測點突變可靠嗎?
         
        答:有的客戶想用測序的方法檢測點突變體,我認為該方法可靠性不高。主要有以下兩個原因。首先,我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測序反應的信號強度直接與模板的量有關,如果突變的模板所占的比例很少,將直接作為背景噪音了,很難檢測出來。只有當測序反應體系中正常的和突變的模板量比較接近時,才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次,在同一位置,不同堿基的信號強度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時,也不一定能準確檢測到突變的存在。另外,測序儀是設計用來測序正常的堿基序列的,軟件在對掃描的結果進行處理時,會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低,以得到盡可能好的結果。因此,當某處出現雙峰時,測序儀一般會認為信號弱的峰為背景信號,在處理過程中,將弱的峰進一步壓低,這樣根部不立于突變體的檢測。因此認為,用測序的方法檢測突變體的存在不是一個好的方法。
         
        13、我要求5’3’正向測序,為什么你們給我的序列是反的?
         
        答:您指的可能是插入片段的方向,而我們并不清楚您的樣品是如何構建的。我們只能根據質粒上的序列來確定測序方向,所以在測序引物一欄中請不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣,因為我們手中的資料在注明方向時可能和您手中的資料方向相反,請以T7,T3,SP6,M13f,M13r這樣的形式來填寫,或注明酶切位點方向比如“測序方向EcoRI到HindIII”。我們手中等質粒資料有限,有時還需要您提供質粒的相關資料。
         
        14、我的樣品在你們所說的可靠范圍內有一處存在疑問,能否重新測一次?
         
        答:我們希望您能夠告訴我們存在疑問的位點的位置,如果從測序報告上的確無法作出準確判讀,我們會重新進行實驗。如果您指出的位點信號清晰準確,您仍然要求再進行一次實驗,那么實驗結果和驗證實驗是相同的。
         
        15、我的樣品送測序前已經鑒定過了,有插入片段的,為什么你給我的測序結果是一個空質粒?
         
        答:造成這種現象主要有兩個原因。
        (1)鑒定過程中的假陽性。鑒定插入片段主要是通過PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應受多種條件的影響,在鑒定過程中易產生假陽性,而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。
        (2)我們由于條件的限制,無法單獨的對某一個客戶的樣品進行特定條件的培養,所以可能在培養過程中發生插入片段的丟失。由于這種情況的發生無法事先預期到,所以我們也只能對出現這樣情況的客戶說抱歉。直接提供質粒雖然可以避免這樣的情況,但由于質粒制備上的問題,測序的成功率可能會受到影響。
         
        16、DNA片段很長,一個反應讀不到頭,怎么辦?
         
        答:如果DNA片段在載體上,可以用載體上兩端的引物同時測序,讓其中間交叉互補,便可完全測通。如果這樣還讀不通,可在已經測出序列的450~500個堿基處設計測序引物作進一步測序(此稱為Primer Walking法),便可完全測序。
         
        17、我的樣品你們已經測通了,但為什么在overlap區有這么多的錯配,給出的全序列和單個報告也稱作差異,我該相信誰?
         
        答:給出的全序列是一個拼接的結果,當互相拼接的兩個序列存在差異時,應該以序列質量更好的應該為主,這也就是為什么會出現錯配和全序列與單個測序結果的差異。
         
        18、你們為什么在primer walking時總將引物設計的那么靠前?
         
        答:我們在設計引物時有兩個準則。一是設計引物區域的序列必須準確,二是在引物區后必須還有足夠的準確序列以便拼接。這樣我們設計引物的位置就必然比較靠前,在滿足軟件設定的條件下,我們總會選取最靠近3’端的引物來作為最終的測序引物。
         
        19、我有一個4KBPCR片段,希望你們幫我測通。
         
        答:大于2KB的PCR片段要測通最好是構建好克隆后再進行測序。這樣模板更加穩定,測序效果也更加好一些。
         
        20、測序完成后,測序樣品和引物將如何處理(或保存)?
         
        答:客戶需要將測序樣品或引物返還時,我們在處理郵件的同時,按客戶要求返回樣品或引物。一般1-2個工作日客戶可以收到,請注意及時和業務員索取。對于沒返回的測序樣品和引物,公司負責保存1個月(從樣品收到之日算起),超過1個月還需用于測序的樣品或引物,請客戶另行提供。
         

         

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